Western Blot為什么必須要用內參？

要檢測一個基因的表達產物是否正確，或者比較表達產物量的相對變化，**方法是Western Blot。因為Western Blot操作相對簡單方便，既可以定性分析表達產物，同時還可以指示目的蛋白量的相對變化。雖然，順利的時候Western Blot做起來很簡單，可不順的時候也很令人心煩――做不出結果啦、假陽性啦、結果出現多條帶啦、到底是一抗有問題還是二抗有問題啦……畢竟，作為一種有 活性的生物大分子，抗體和抗原的反應畢竟不象1+1那么明確，而用這種不確定的試劑來測定同樣知之甚少的表達產物，確實是有一定的不確定性的。所以，嚴謹 的Western Blot實驗設計中要求有良好的參照體系，對實驗結果分析是非常有用。特別是當實驗出現問題時，借助參照體系很容易就可以查出問題所在，而不必抓耳撓腮怨 天尤人。良好的參照體系通常包括分子量Marker（用來確定蛋白條帶對應的分子量大?。?，空白載體對照（如果是誘導表達體系還應該有誘導前的對照），已 知量標準產物的正對照；另外還有內參?？墒怯捎诮涃M限制或者偷懶的原因，國內的不少人做Western Blot往往省略參照，導致結果出現問題時無法分析結果――即便有結果也可能影響結果的分析。

        內參是**容易被忽略的一項。我們知道，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達量的相對多少，前提條件是等量的細胞上樣，才有比較的基礎。特別表達量不高時，上樣量的差別就很可能影響結果的分析。所以你需要內參。

        內參即是內部參照（Internal Control），對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測蛋白的表達水平變化時常用它來做參照物。在Western Blotting 實驗中，除了需要進行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進行內參的檢測，以校正蛋白質定量、上樣過程中存在的實驗誤差，保證實驗結果的準確性。

        在國外發表的文章中，Western Blotting 實驗結果須進行內參校正已成為一種慣例。但是，國內仍有不少科研人員在Western Blotting實驗中忽略了內參的使用，將蛋白濃度測定作為規范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的**方法。然而各種蛋白質濃度定量方法，都存在局限性，不能完全準確的確定各種樣品的準確蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質，相對于比色法來說，操作簡單，但是容易受到平行物質的干擾，如DNA 的干擾；且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測定蛋白濃度一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度**高，且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的，其**主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。另外，蛋 白質定量以后進行電泳時需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Western blotting實驗時使用內參，即可簡便地對定量和上樣步驟產生的誤差進行校正。

        在Western Blotting中使用內參其實就是在WB過程中的另外用內參對應的抗體檢測內參，這樣在檢測目的產物的同時可以檢測內參的表達，由于內參在各組織和細胞 中的表達相對恒定，借助檢測每個樣品內參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結果才更為可信。此外使用內參可以作為空白對照，檢測蛋白轉膜情況是否 完全、整個Western Blot顯色或者發光體系是否正常。

        實 驗結果分析其實很簡單：如果樣品蛋白量有限，只夠進行一次電泳轉膜實驗時，分別檢測樣品的內參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內參含量，得 到的數值即為內參校正后的各樣品中目的蛋白相對含量，再用此數值進行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實際變化結果。如果樣品量充分， 可以先檢測內參，觀測樣品間內參顯色條帶是否一致，根據差異大小調整各樣品的上樣量重新進行Western Blotting實驗，**內參量一致為止；若內參一致，即可進行不同樣品間目的蛋白表達變化分析。這樣雖然麻煩一點，但是可以保證結果更有說服力，更可信。畢竟我們的實驗是一種嚴謹的工作。

        附：在Western Blotting實驗過程中使用內參的方法有：

        一、 超級簡便的標記內參使用法：只要在二抗孵育時加入HRP標記內參抗體，按照正常操作即可。

        二、普通內參：當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量相差不大時，可以先進行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測。然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體，重新進行內參蛋白的抗體溫育、顯色檢測。

        三、當目的蛋白的分子量大小與選用的內參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉膜后預染，根據蛋白質Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量兩部分，使內參蛋白與目的蛋白分開。然后兩塊膜分別與內參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進行溫育，二抗溫育以及顯色。