Westernblot基本流程
1.蛋白處理：此步驟是關鍵，蛋白處理的好否決定結果好壞。取細胞，3000rpm 3min離心，加入含蛋白酶抑制劑（現做現加）的細胞裂解液(本實驗室選擇RIPA，1×106/L細胞對應100ul)，槍尖反復吹吸裂解細胞（此步非常重要，容易出現鼻涕樣的液體，此為裂解不充分的緣故，所以應反復吹打或者置于振蕩器上，直**鼻涕狀液體消失）。冰上放置**少半小時。
2.煮蛋白：12000rpm，15min離心，吸取上清，加入Loading buffer后于沸水中煮5min后,放于-80保存。
3.清水洗玻璃板，無水酒精擦洗干凈，夾膠圈，防止漏膠。
4.配制10%分離膠，加入垂直板中，再加入1ml水液封（加入TEMED立即搖勻加入，加水液封時要緩慢些，防止把膠沖變形）。
5.20分鐘后，把上清水倒掉，用濾紙把剩余的水吸干。配制5%濃縮膠（按1.5倍體積配液，保證足量），立即加入分離膠上層（**不能出現空泡），立即插梳子。10-20分鐘后等膠凝固。
6.準備樣品及marker、loading buffer，如果樣品是之前保存的，則應再次煮沸5min。
7.將含膠的玻璃板裝入
電泳槽內，加入電極緩沖液（**好是新配制的），保證玻璃板內的液面高于玻璃板外。拔出梳子，拿注射器將每個加樣孔吹一次，把其中可能存在的碎膠吹走，避免影響加樣。
8.上樣：本人上樣有2個習慣。1.上樣必須快些，如果上樣時間超過半個小時以上，可能會出現孔中樣品彌散出來。
2.每個孔均加40ul：樣品40ul，Marker加完后再加Loading40ul，非上樣孔上loading buffer40ul，保證整塊膠重量平衡
9.電泳：本人采用恒流電泳，一塊膠10mA（兩塊則20mA），等染料進入分離膠后，電流加大**20mA，總共約3-3.5h，電泳時周圍可放置冰塊，起到
電泳槽散熱的效果。
10.準備好電轉液，濾紙、PVDF膜或者NC膜。電泳結束后，取下凝膠，Marker處做標志。上下各四層濾紙（5×8cm），下膜（5.5×8.5cm），上膠，本人用半干轉移儀，電流設置為1塊膠45mA，轉移3.5h。（注意：1.濾紙、膜必須經過電轉液浸泡，PVDF膜還得甲醇浸泡 2.上下濾紙之間不能有接觸，避免短路 3.膜與膠之間不能有氣泡 4. 正反極一定得正確，否則蛋白就轉移到濾紙上了）
11.封閉：5%脫脂牛奶室溫封閉2h或者4度封閉過夜
12.洗膜：含0.1%Tween-20的PBS洗滌三次，每次5min（提高Tween-20濃度可以去背景）
13.孵育一抗：室溫2小時或者4度過夜。**好一次孵育**多兩張膜，太多的膜可能一抗結合效果不佳。
14.洗膜：同前
15.孵育二抗：室溫一小時（時間過長不宜），不推薦4度過夜
16.洗膜:同前
17.壓片：具體步驟不贅述。注意點如下：1.壓片時間得由ECL液中顯影強度決定，短則2-10秒，長則2-5min
2.一般同時壓2--4張片子，**底下那張一般太黑沒法用。所以我**底下那張一般不換，壓其他的膜也用這張做**底下一張，可以節省膠片
18.壓過的膜還可以重新洗膜后孵育新的一抗、二抗。
這就是自己做Westernblot的一般流程，其中犯過很多錯誤，尤其是一些注意點其實都是自己的出錯的地方。寫出此貼，也是希望能幫助更多的朋友初步學習Westernblot，其中有不對的地方還希望大家批評指正。
