凝膠電泳染色:使用什么?
電泳是鑒定和分離大分子的常用實驗室程序。它在19世紀初由莫斯科的一名大學科學家**觀察到。像許多發現一樣,這是偶然的,但已被證明對許多研究場景有用。通過施加電力,技術人員使用顆粒的負電荷或正電荷使其通過多孔基質(例如瓊脂糖凝膠)遷移。當樣品中存在帶正電的分子時,它們會向負電流(陰極)蠕變,而帶負電荷的分子則會遷移到正電流(陽極)。
除了電力和凝膠的來源之外,此動力學測試需要緩沖劑以幫助防止溫度和pH極端值。所用凝膠的類型取決于樣品和應用。凝膠是“固體”,但多孔。在凝膠中,較大的分子會移動得更慢,而較小的分子會快速移動。因此,分子大小是樣品分離和分子鑒定的另一種方式。
所以,現在我們了解了電泳的動力學,我們如何看到這些粒子在哪里移動?分子可能是“宏觀的”,但它們仍然太小而不能用肉眼觀察。我們實驗的**后一個必要成分是染色劑。一組染料可以讓我們看到顆粒所走的路徑。從那里,我們可以捕捉圖像以記錄結果。
DNA凝膠染色
存在幾種用于在凝膠電泳期間染色核酸的選擇。溴化乙錠(EtBr)是**常用的DNA染料。它是一種嵌入劑,與DNA結合,當暴露于紫外線時熒光增加20倍。EtBr是**便宜的DNA染色劑,使其成為許多研究實驗室的理想選擇。但是,EtBr必須小心使用,因為它是已知的誘變劑。此外,EtBr需要暴露于紫外線下才能看到,但會發生分子破壞。當DNA被用于諸如克隆之類的下游應用時,這就出現了一個問題。
替代DNA染料,如SYBR Safe,已經開發出來,它們不具有與EtBR相同的致突變性質。SYBR Safe不被認為是危險的,可以使用實驗室的常規污水系統進行處理。此外,它在藍光下發出熒光,防止使用紫外光時發生DNA損傷。
已顯示許多DNA染色劑抑制聚合酶鏈式反應(PCR)。當需要高PCR效率時,如實時定量PCR,可行的DNA染色劑將是Eva Green。與其他常用電泳染料相比,它在較小程度上限制了PCR。伊娃格林也比傳統的污漬如EtBr更安全。
蛋白質凝膠污漬
與DNA凝膠相似,染色蛋白凝膠有幾種選擇。兩種**常見的污漬是考馬斯亮藍和銀染??捡R斯是一種陰離子染料,它非特異性地與蛋白質結合。一旦多余的污漬被去除,蛋白質條帶就會顯現為藍色條帶。由于易于使用且價格合理,考馬斯染色法是蛋白質染色**常用的方法。
相反,銀染比考馬斯用于檢測相對較低量的蛋白質更敏感。但是,靈敏度帶來了一個代價,因為銀染色也能與多糖和核酸結合,在銀染凝膠上產生假帶。